Иммуноферментный анализ

01.10.2009

Лабораторная диагностика нарушений репродуктивной системы (часть 2)

Первым этапом лабораторного обследования лиц обоего пола, страдающих нарушениями репродуктивной функции, по рекомендации ВОЗ является измерение концентрации пролактина (молочного гормона) в сыворотке (плазме) крови. Пролактин не оказывает непосредственного влияния на функциональную активность половых желез, в то же время уровень пролактина в крови четко коррелирует с состоянием гипоталамуса и аденогипофиза. Пролактин регулирует секрецию молока во время лактации.  Пролактин является гормоном-антагонистом ФСГ и ЛГ, и при повышении выработки пролактина нарушается гормональная функция яичников и возникает гиперпролактинемическая форма бесплодия. Физиологическая гиперпролактинемия наблюдается у женщин, кормящих грудью. У некормящих женщин повышенный уровень пролактина может быть связан с приемом некоторых лекарственных препаратов, опухолью гипофиза или нарушением его работы. Одним из проявлений гиперпролактинемии является выделение молозива или молока из молочных желез, особенно у нерожавших женщин. Патологические изменения в организме, при повышенных или пониженных уровнях пролактина представлены в таблице 1.

Таблица 1. Патологические изменения в организме при повышенных или пониженных уровнях пролактина

Показания к определению:

Женщины детородного периода:

• Нарушения менструального цикла и аменорея
• Бесплодие
• Нарушения лактации
• Галакторрея
• Синдром гиперфункции гипофиза
• Недостаточность гипофиза
• Заместительная терапия после удаления опухоли гипофиза

Мужчины:

• Тестикулярная недостаточность
• Азооспермия, олигоспермия
• Галакторрея
• Синдром гиперфункции гипофиза
• Недостаточность гипофиза
• Заместительная терапия после удаления опухоли гипофиза

Пролактин имеет довольно выраженный циркадный ритм с максимальным выбросом гормона во время ночного сна. Забор крови рекомендуется проводить утром (8-10 ч), в раннюю фолликулиновую фазу цикла (у женщин с регулярным циклом) и в спокойной обстановке. Для исключения случайного повышения уровня пролактина в ответ на стресс (взятие крови) желательно 2-3-кратное исследование.

• сыворотка крови
• гепаринизированная плазма крови

ФСГ и ЛГ - «основные» гормоны репродукции

Если определение уровня пролактина в крови дает информацию о функциональном состоянии гипоталамо-гипофизарного комплекса в целом, то для оценки активности репродуктивной системы применяют измерение содержания в крови гонадотропных гормонов - ФСГ и ЛГ.

Именно эти гормоны обеспечивают рост и развитие фолликулов (ФСГ) и стимулирует синтез половых гормонов в гонадах (ЛГ). Секреция ЛГ и ФСГ находится, в свою очередь, под контролем половых гормонов гонад (механизм отрицательной обратной связи). Повышение уровня половых гормонов, прежде всего эстрадиола, в крови сопровождается угнетением секреции гонадотропинов (и наоборот). Секреция ФСГ дополнительно регулируется ингибином - полипептидом, синтезируемым гонадами. В предовуляторный период созревший доминантный фолликул секретирует в кровь большие количества эстрадиола, под влиянием которого происходит овуляторный выброс ЛГ и ФСГ (феномен положительной обратной связи). Этот подъем (овуляторный пик) продолжается очень недолго, 1-2 дня. Интенсивность секреции гонадотропинов в периовуляторный период определяет будущую функциональную активность желтого тела. Суточный (циркадный) ритм секреции ЛГ и ФСГ у взрослых людей не выражен, в отличие от подростков, в то же время цирхоральный (почасовой) ритм секреции очень характерен именно для гонадотропинов.

Современные  ИФА тест-системы на определение ФСГ и ЛГ основаны на использовании монклональных антител, которые не имеют перекрестной реакции с близкородственными гормонами ТТГ и ХГЧ.

 Подготовка проб для анализа

Уровни гонадотропинов не имеют циркадного ритма, нет необходимости брать кровь натощак. Следует учитывать, что при сохраненном менструальном цикле однократное определение гонадотропинов может производиться только в раннюю фолликулиновую фазу (6-8-й дни цикла). Более четкие результаты получают при заборе 2-3 проб крови с интервалом 30-40 мин и последующем объединении полученных сывороток. Нельзя однократно определять ЛГ и ФСГ в пробе крови, взятой в середине цикла, для детекции овуляции. Сроки овуляции для циклов разной продолжительности различны (примерно за 14 дней до начала ожидаемой менструации) и могут сдвигаться на 1-2 дня от предполагаемых. В связи с этим результаты однократного определения гонадотропинов на 13-14-й дни цикла в большинстве случаев дают ложную информацию о характере цикла. Пульсирующий характер секреции с интервалами в 1-2 часа особенно характерен для ЛГ, поэтому результаты единичных анализов следует считать приблизительными. Образцы сыворотки или плазмы крови после образования сгустков и/или отделения эритроцитов стабильны в течение времени, достаточного для пересылки образцов по почте. Замороженные образцы можно хранить в течение длительного периода времени.

Не рекомендуется использовать гемолизированные, липемические или иктерические образцы, так как это может оказать влияние на результаты анализа.

Кровь необходимо отбирать иглой с широким просветом, самотеком либо при незначительном отрицательном давлении поршня шприца.

• сыворотка крови
• гепаринизированная плазма крови

Несомненно, что для полного обследования состояния репродуктивной системы необходимо наличие ИФА тест-систем для определения половых гормонов (эстрадиола, тестостерона, прогестерона) в сыворотке крови. Если синтез половых гормонов в гонадах резко снижен, то по механизму отрицательной обратной связи секреция гонадотропинов резко увеличивается так, что диагноз отсутствия функции яичников не вызывает затруднений.

В диагностическом алгоритме обследования при подозрении на эндокринное бесплодие ключевым является определение концентраций ЛГ, ФСГ, эстрадиола и тестостерона.

Методы определения этих гормонов на сегодняшний день преимущественно базируются на иммунноферментной или иммунофлуоресцентной технологии, что обеспечивает их широкое применение.

Эстрадиол – основной эстрогенный стероидный гормон. Катаболизм в печени приводит к трансформации эстрадиола в эстриол или же в глюкурониды и сульфаты, выделяемые в мочу.

У женщин эстрадиол синтезируется и секретируется в яичниках, в оболочке и гранулезных клетках фолликулов. Он стимулирует развитие первой фазы овариального цикла, вызывая увеличение мышечного белка матки и гиперплазию эндометрия. На гипофизарном уровне он также действует на секрецию ЛГ, ФСГ. В течение первой фазы цикла нарастающее увеличение концентрации эстрадиола приводит к массивной секреции ЛГ, который “запускает овуляцию”. При беременности концентрация эстрадиола увеличивается. Анализ эстрадиола в плазме крови является основным параметром в слежении за индукцией овуляции и стимуляцией яичников. Увеличение скорости синтеза эстрадиола и его концентрация в конце стимуляции отражает число и качество созревающих фолликулов.

Таблица 4. Референтные величины концентрации эстрадиола в сыворотке крови.

Показания к определению:

• контроль за стимулированной овуляцией,
• оценка функции яичников,
• нарушения менструального цикла,
• аменорея гипоталамического происхождения,
• опухоли, вырабатывающие эстрогены,
• контроль за лечением бесплодия,
• остеопороз;

• гинекомастия,

дети:

• наблюдение за ходом полового созревания.

Прогестерон – один из основных стероидных гормонов. Он секретируется в небольшом количестве клетками желтого тела яичников в лютеиновой фазе менструального цикла. Он действует на эндометрий вместе с эстрадиолом, вследствие чего менструальный цикл переходит из пролиферативной фазы в секреторную. Уровень прогестрерона достигает своего максимума на 5 – 7-й день после овуляции. Если не происходит оплодотворения, уровень прогестерона уменьшается, и наоборот, если оплодотворение произошло, желтое тело продолжает секретировать большое количество прогестерона до 12 недель беременности. Затем включается в действие плацента, которая становится основным участком выработки гормона. Прогестерон также секретируется в небольших количествах корой надпочечников и семенниками и является промежуточным звеном в синтезе андрогенов.

В крови прогестерон находится как в свободном, так и в связанном с белками переносчиками (альбумин и транскортин) состояниях. Период полураспада гормона составляет несколько минут, две трети прогестерона метаболизируется в печени и секретируется в мочу в виде свободного прегнандиола, глюкуронида прегнандиола и сульфата прегнандиола.

• нарушения овуляции,
• отсутствие овуляции с олигоменореей или без нее,
• недостаточность функции желтого тела;
• точное определение овуляции
• индукция овуляции человеческим гонадотропином менопаузы или кломифеном (как в присутствии ХГЧ, так и без него);
• подтверждение овуляции (определение во второй половине цикла);
• наблюдение за ходом овуляции у женщин, перенесших самопроизвольный аборт;

• дефект биосинтеза стероидов.

Прогестерон вызывает увеличение базальной температуры тела. В случае диагностики недостаточности функции желтого тела, пробы берутся 3 раза (каждая после 3-4 дней предыдущего взятия). По крайней мере, в 2 случаях концентрация прогестерона должна превышать 10 мкг/мл. 

Тестостерон

У женщин тестостерон образуется в коре надпочечников и яичниках в соотношении 1:1 и служат субстратом для образования эстрогенов, а также стимулирует предовуляторый выброс ЛГ. Уровни тестостерона у женщин с возрастом не изменяются. Уровни тестостерона в норме у женщин –    0 – 0,9 нг/мл.

• синдром Клайнфельтера и другие хромосомные заболевания;
• гипопитуитаризм;
• ферментативные нарушения синтеза андрогенов;
• гирсутизм и вирилизация женщин;
• большинство андрогенвырабатывающих опухолей яичников и почек.

 У женщин необходимо также определять уровень ДГЭА – сульфата, который обладает сходным с тестостероном действием (у мужчин является вспомогательным средством при исследовании тестостерона).

• сыворотка крови женщин на 3 –7 день менструального цикла, лучше между 8 и 10 часами утра.

 Таблица 7. Референтные величины концентрации ССГ в сыворотке крови

17а-Гидроксипрогестерон (17ОН-П) - промежуточный стероид в биосинтезе глюкокортикоидов, андрогенов и эстрогенов, который синтезируется из прогестерона и 17а-гидроксипрегненолона. Секретируемый корой надпочечников, яичниками и семенниками, он циркулирует в крови, как в свободном, так и связанном, подобно прогестерону, с двумя белками - альбумином и транскортином, состоянии. Период полужизни 17ОН-П составляет несколько минут. Он метаболизируется печенью и выделяется в мочу в виде прегнантриола.

17ОН-П вырабатывается в небольших количествах яичниками во время фолликулярной фазы, затем его концентрация возрастает и остается постоянной в течение лютеиновой фазы. Если оплодотворения не происходит, уровень 17ОН-П уменьшается. При имплантации оплодотворенной яйцеклетки желтое тело продолжает секретировать 17ОН-П.

Анализ 17ОН-П очень важен для диагностики врожденной гиперплазии надпочечников и обнаружения дефицита фермента, ответственного за возникновение данного заболевания.

Уровень 17ОН-П в крови особенно показателен и имеет решающее значение в диагностике дефицита 21-гидроксилазы у новорожденных.

В зрелом возрасте при частичном или поздно проявившемся дефиците фермента основной уровень активности 17ОН-П может быть в норме или повышен

• врожденный дефицит фермента, ответственный за возникновение гиперплазии надпочечников;
• заболевания, связанные с дефицитом 21-гидроксилазы у новорожденных (высокий уровень 17ОН-Р);
• частично или поздно проявившаяся нехватка 21-гидроксилазы (нормальный или высокий уровень 17ОН-Р);
• дифференциальная диагностика бесплодия.

• сыворотка крови;
• плазма крови с добавлением гепарина.

 Дегидроэпиандростерон

Дегидроэпиандростерон (ДГЭА) - один из наиболее важных андрогенов (точнее их предшественник), синтезируемый корой надпочечников и половыми железами из 17ОН-Р. Он катаболизируется в вирилизирующие андрогены: андростендиол, тестостерон и дигидротестостерон.

Большая часть ДГЭА модифицируется путем присоединения сульфата в (ДГЭА-С), который биологически неактивен, но удаление сульфатной группы, восстанавливает активность ДГЭА. ДГЭА фактически является прогормоном, обладает более коротким периодом полужизни и более высокой скоростью метаболического обмена, в связи, с чем его концентрация в крови в 300 раз ниже уровня ДГЭА-С.

ДГЭА характеризуется циркадным уровнем секреции с максимальным выбросом гормона в утренние часы. В менструальном цикле значительных изменений его концентрации не наблюдается. В отличие от тестостерона, ДГЭА в циркулирующей крови не связан с ССГ, поэтому изменение концентрации связывающих белков не влияет на его уровень.

• гирсутизм;
• вирилизация;
• задержка полового созревания

•  сыворотка крови;
•  плазма крови с добавлением гепарина.

 Дегидроэпиандростерон-сульфат

ДГЭА-С синтезируется в надпочечниках (95%) и в яичниках (5%), выделяется с мочой и составляет основную фракцию 17a-кетостероидов. Определение ДГЭА-С концентрации в сыворотке крови заменяет исследование 17a-кетостероидов мочи.

ДГЭА-С секретируется со скоростью 10-20 мг/24 часа (35-70 мкмоль/24 часа) у мужчин и 3,5-10 мг/24 часа (12-35 мкмоль/24 часа) у женщин, причем, без циркадного ритма. Он не связывается со специфическими белками плазмы крови и, следовательно, их концентрация не влияет на уровень ДГЭА-С. Однако ДГЭА-С связывается с альбумином сыворотки крови.

Кроме ДГЭА-С в циркулирующей крови присутствует ДГЭА, составляющей ¼ и ½ от скорости секреции ДГЭА-С у мужчин и у женщин, соответственно. Благодаря высокой концентрации ДГЭА-С в крови, длительного периода полужизни и высокой стабильности, а также потому, что его источником, в основном, являются надпочечники, ДГЭА-С является отличным индикатором андрогенной секреции.

Если у женщин наблюдается повышенный уровень тестостерона, то с помощью определения концентрации ДГЭА-С можно установить связано ли это с нарушением функции надпочечников, или с заболеванием яичников.

• 1 нг/100мл = 28,8 нмоль/л;
• 1 нмоль/л = 2,6 нг/мл
• 1 нг/мл = 368,46 мкмоль/л

• опухоли надпочечников;
• дифференциальная диагностика заболеваний яичников;
• остеопороз;
• задержка полового созревания.

•  сыворотка крови;
•  плазма крови с добавлением гепарина.

Физиологическое истощение фолликулов яичников у женщин происходит в возрасте 45-55 лет. При прекращении функции яичников до 40 лет свидетельствует о заболевании, известным как, преждевременная недостаточность яичников. Следствием этого заболевания является бесплодие. В ряде случаев, причиной этому может быть аутоиммунный процесс, связанный с образованием антител к половым гормонам яичников.

В некоторых случаях развитие бесплодия у мужчин обусловлено наличием в сыворотке кроки или семенной плазме специфических антител.

Овариальные антитела в сыворотке крови

В норме в сыворотке крови женщины овариальные антитела отсутствуют. Овариальные антитела (к антигенам яичников) были обнаружены у женщин при преждевременной менопаузе, бесплодии и при оплодотворении invitro. Эти антитела могут вырабатываться клетками Лейдига, грануцилезными клетками яичников и клетками плаценты. Для определения антител к половым гормонам используют метод непрямой иммунофлюресценции и ИФА. ИФА метод позволяет определять, как суммарные, так и антитела к различным классам иммуноглобулинов (IgG, IgM, IgA). Аутоиммунные антитела можно обнаружить в крови женщин за много лет до развития клинических проявлений преждевременной недостаточности яичников.

Помимо овариальных антител метод ИФА позволяет выявлять антитела к прозрачной оболочке ооцита – суммарные и антитела к классам (IgG, IgM, IgA), которые имеют такое же диагностическое значение, как и овариальные антитела.

У женщин выявить четкую корреляцию между концентрацией антител в сыворотке крови и прогнозом в отношении фертильности обычно не удается.

Антиспермальные антитела в сыворотке крови

В норме в сыворотке крови женщины антиспермальные антитела отсутствуют. У мужчин антиспермальные антитела образуются в результате аутоиммунной реакции на спермальный эпителий. Причиной развития такой реакции может быть травма яичка, бактериальные и вирусные инфекции, хирургические операции на яичке. Для определения антиспермальных антител в настоящее время применяют метод ИФА, который отличается большой чувствительностью и специфичностью, а также позволяет количественно определять антитела различных классов иммуноглобулинов (IgG, IgM, IgA), что позволяет оценить остроту и выраженность аутоиммунного процесса. Кроме того, у мужчин концентрация антиспермальных антител коррелирует в отношении восстановления способности к оплодотворению.

У женщин в норме антитела против антитегов сперматозоидов не вырабатываются, однако различные этиологические факторы (инфекции, аутоиммунные заболевания) могут приводить к потере иммунологической толерантности. Если в крови женщины присутствуют антиспермальные антитела, тогда нарушаются процессы формирования трофобласта, рост и формирование плаценты, имплантации. А это приводит к прерыванию беременности, гестозу, задержке развития плода, фетоплацентарной недостаточности.

Исследование на антиспермальные антитела рекомендуют проводить у всех пар с необъяснимым бесплодием. 

Хорионический гонадотропин (ХГч) в сыворотке крови

ХГч - гликопротеин с молекулярной массой приблизительно 46000, состоящий из двух субъединиц- альфа и бета. Повышенный уровень ХГч в сыворотке крови обнаруживают уже на 8-12–й день после зачатия. В течение I триместра беременности концентрация ХГч быстро нарастает, удваиваясь, каждые 2-3 дня. Максимум концентрации приходится на 7-10-е недели беременности, после чего концентрация ХГч начинает снижаться, и в течение второй половины беременности остается более или менее стабильной. 

В таблице 11 приведены концентрации ХГч в сыворотке крови женщины в динамике физиологической беременности.

Во втором триместре беременности, при наличии у плода синдрома Дауна, концентрация ХГч в крови повышена, концентрация АФП (см. ниже) понижена. С учетом этого, ИФА исследование на АФП и ХГч используются в качестве метода массового пренатального скрининга во II триместре беременности. Значения медиан концентрации ХГч для скрининга врожденных пороков развития плода во II и III триместре приведены в таблице 12.

Таблица 12. Значения медиан концентрации ХГч для скрининга врожденных пороков развития плода во II и III триместре

Альфа-Фетопротеин (АФП) в сыворотке крови

АФП - гликопротеин с молекулярной массой приблизительно 65000 кДа, секретирующийся плодной печенью и желточным мешком. АФП у плода является основным белком сыворотки, у взрослых содержание АФП в сыворотке крови незначительно. Во II триместре беременности, при наличии у плода синдрома Дауна, концентрация АФП понижена, а концентрация ХГч в крови повышена. С учетом этого, ИФА исследование на АФП и ХГч используют в качестве метода массового пренатального обследования беременных, с помощью которого можно выделить группу высокого риска по наличию у плода пороков развития или синдрома Дауна. Значения медиан концентрации АФП в сыворотке крови для скрининга врожденных пороков развития плода во II триместре приведены в таблице 13.

Таблица 13. Значения медиан концентрации АФП для скрининга врожденных пороков развития плода во II триместре

 Свободный эстриол в сыворотке крови